频谱仪照射对大鼠皮肤创伤愈合的影响
北京医科大学心血管基础研究所
李田昌 董林旺 庞永政 李 亮 赵 东 唐朝枢
周林频谱总公司 陈天曦
前言
创伤愈合不仅取决于创伤的严重程度，还与机体的全身及局部组织状态有关。用物理方法增强机体愈创能力与药物治疗相比具有经济，易行，安全性高，副作用少等优点，有广泛的应用前景。近年来，周林频谱仪作为新型的简便理疗仪进入医疗单位和居民家庭，据报道对于多种疾病均有较好疗效，但是目前对其作机理尚不十分清楚。本工作在大鼠皮肤切割伤和烫伤的复合创伤模型上，观察频谱对创伤愈合的影响，并对其可能作用机制加以探讨。
实验材料与方法
１． 实验动物：健康Wistar大鼠，体重250－300g，雌雄不限；健康雄性新西兰家兔，体重1.4kg，均由北京医科大学动物中心提供。所有动物于实验前一周饲养于室温、12小时／12小时光暗交替的通风环境下，室温21-25℃。实验前12小时禁食，自由饮水。
２． 主要试剂：3H胸腺嘧啶（3H－TdR）购于北京原子能研究所，放射比活性为41Ci/mMol,MEM培养液为Sigma Co产品，小牛血清购自北京凯生科技有限公司，PPO及POPOP为Sigma Co产品，其余试剂除特殊表明外，均有市售分析纯产品。
３． 主要仪器：频谱仪（WS－301C型）为云南生物医学工程研究所产品，721分光光度计（上海），Pharmaci Wallac 1410型液闪计数仪（瑞典），302型NaPCO CO2孵箱（美国），202－1型电热干燥箱（江苏），Sartutius光电分析天平（德国），LD4－2A型离心机（北京），Ultra-turraxT25型匀浆器（台湾），RC5C型超速冷冻离心机（美国）。
４． 大鼠复合创伤模型的制作：0.6％戊巴比妥钠5ml/kg(30mg/kg)i.p.麻醉。背部及臀部用电推子推去毛，并用20％温硫化钠涂抹均匀，温水洗净脱毛。背部正中作2cm长全层皮肤切口（深达肌膜），以3－0线缝合3针，针距0.5cm。将大鼠臀部浸入95℃热水中20秒（注意保护外阴），造成深Ⅱ度烫伤，面积约为4cm×4cm。术后放回笼中，单独饲养。
创伤动物随机分为下列三组：1．假手术组(Sham group,S)，取8只健康大鼠，仅备皮，但不作创伤修理（见下）；2．单纯创伤组(Control group,C)，创伤后不作特殊治疗处理；3．创伤动物于术后48小时起，用频谱仪（E）进行照射，每日四次（8am、11am、4pm、8pm），每次45min。照射距离以使动物周围温度上升4℃为宜。2和3组又各分为三个亚组，每个亚组n=8,分别于术后3天，6天和9天在20％乌拉坦（5ml/kgi.p.）麻醉下取标本测量下述指标（见后）。
５． 创口撕裂张力(Wound Break Strength,WBS)测定，依Hogstrom等人方法改良[1]。拆除背部切割伤处手术缝线，以切口为中心，取1cm×1cm全层厚皮瓣（分离皮下筋膜），用两把Allis钳对称地钳夹于切口两侧皮瓣边缘，将一把Allis钳悬挂于一支架上，另一把悬空，并在其下方挂一塑料容器，向容器内恒速注入自来水(50ml/min)，直至皮瓣在切口处裂开为止。下方Allis钳与容器及容器内水的重量之和则为WBS，单位为克，每次作两个皮瓣测定，取其平均值进行记录。
６． 创伤皮肤胶原含量的测定 胶原中羟脯氨酸含量比较恒定，约占14％，且羟脯氨酸在其它蛋白质分子中含量极低，所以可用组织中羟脯氨酸含量表示组织胶原含量[2]。
将上述测WBS的皮瓣称量，剪碎，用2ml蒸馏水制成匀浆(13,500rpm,45min)，加入0.5ml4℃50％三氯乙酸，充分混匀，离心（5000rpm,20min，4℃），弃上清用2ml蒸馏水悬浮沉淀加入0.25ml 1M NaOH混匀，再加入2ml浓盐酸混匀，置于烤箱（试管加盖）110℃。12小时，冷却后再置80℃水浴蒸干，加1ml蒸馏水复溶后，按Bergman方法测定样一中羟脯氨酸含量。简述如下[3]:
１） 氧化液的配制
a：7％氯胺T水溶液（W：V）。
b：乙酸盐／枸橼酸盐缓冲液的配制：称取乙酸钠（3H2O）57克，枸橼酸钠（2H2O）37.5克，枸橼酸（H2O）5.5克，异丙醇385ml，加蒸馏水至1000ml。
c：用前按1：4（V：V）混合a、b液，备用。
２） Ehrlich's试剂的配制：
a：二甲胺－苯甲醛2.0克，60％高氯酸（比重1.56）3ml混匀，用前配制或储存于避光瓶中。
b：异丙醇。
c：用前按3：13（V：V）混合a、b液，备用。
３） 用羟脯氨酸和0.001N盐酸配制不同浓度的羟脯氨酸标准溶液。各取1ml标准溶液，加2 ml异丙醇和1 ml氧化液，混合4min，加入13ml Ehrlick's溶液，混匀60℃水浴25min，冷却，加异丙醇至50 ml，在分光光度计上测OD558nm的光密度，绘制标准线曲。
４） 取1 ml待测样本溶液，按步骤3测量其光密度，后从步骤曲线上查出样本羟脯氨酸含量。以每mg皮肤湿重所含有的羟脯氨酸nmol数表示。即nmol/mg dw.
7．皮肤生长因子（GFs）活性测定[4]：分别取切割伤及烫伤皮肤各100mg，加入1 ml磷酸缓冲液制作匀浆（13，500rpm×45sec）, 离心(1000×g,10min)，上清备用。
家兔主动脉平滑肌细胞（VSMC）的培养参照Ross的贴块法[5]加以改良。家兔在20％乌拉坦（5ml/kg）i.v.麻醉下，无菌开胸，取出主动脉胸段，去除结缔组织、内皮及外膜，剪成1mm2大的组织块，加入含20％小牛血清的MEM培养液，于37℃5％CO2－95％空气条件下培养。待长成单层的细胞后，弃去培养液，加入5％胰酶和Versene液（2：1混合），细胞放回孵箱，显微镜下见细胞园变后，刮下细胞，吸入试管，离心（1000 rpm，10min）收集细胞，分种于培养瓶中。取培养的第四代VSMC接种于24孔板中玻璃盖片上，无血清培养48小时换MEM液，备用。
在上述更换过MEM液的VSMC中加入5％（V：V）上述皮肤组织匀浆上清和1μCi3H-TdR孵育24小时用MEM洗涤后，3％缓冲戊二醛固定，乙醇脱水，浸入KodanNTB－2自显影乳液中3天，冲洗，亚甲兰染色，光镜下数放射性标记的细胞数，GFs活性按标记的细胞数占总细胞数的百分率表示。
8．烫伤组织脂质过氧化产物丙二醛（MDA）的测定：参照Asakawa的方法[6]取烫伤皮肤约100mg，加入1ml蒸馏水，制作组织匀浆（13，500 rpm，45sec）,取20μl组织匀浆＋硫化巴比妥酸液（取硫代巴比妥酸，用10％高氯酸本配成0.67％的过饱合溶液，再与20％三氯乙酸以3：2的体积比混匀）3.0ml，混匀，95℃水浴中30 min，自来水中冷却，离心（3000 rpm，10min），上清在分光光度计上比色（OD532nm)，以1，1，3，3，四乙氧基丙烷（tetraethoxypropane Tep,Sigma CO）为标准测定样品中MDA含量，按组织湿重／干重比（见下）换算为nmol/mg dw。
9．烫伤组织髓过氧化酶（MPO）含量的测量 依Lefer等的方法进行测定。
取烫伤皮肤100mg，加0.5％hezadecyltiimethylammonium bromied(HTAB,Siigma Co)1.5ml制作匀浆（13，500 rpm，45sec），离心（12，000 ×g ，20min，4℃），移去上清，反复冻融三次，氯仿抽提，再次离心（1000 ×g ，20min）100μl上清加514μl0.01mol/L磷酸缓冲液[pH6.5,含有0.0006％过氧化氢、2 mol/L EDTA和1.56mg/ml O－dianisidme dihydrochloride(SigmaCo)]86μl，在分光光度计上（OD460 nm)比色，测量MPO活性。1MPO活性单位表示在25℃时每分钟可降解1μmol过氧化氢的酶量。
10．烫伤组织DNA合成（3H－TdR参入）的测定 将50 mg烫伤组织切成4小片，浸入2 mlMEM培养液中（含有10％小牛血清），加入2μCi3H－TdR，于95％空气－5％CO2孵箱中孵育24小时，用冷PBS洗三次，滤纸吸干后加入0.25ml80％甲酸消化（80℃水浴2小时），再加入10 ml闪烁液（PPO5.0g,POPOP 0.5g,二甲苯700 ml，无水乙醇300 ml）避光静置过夜，在β液闪计数仪上测定3H－TdR参入的放射活性，以cpm/mgdw表示。
11．烫伤组织血管通透性改变[8]切伤及烫伤皮肤取材后，由股静脉推注1％Evans Blue(EB),(溶于生理盐水)2ml/kg,10分钟后取剩余的烫伤部位皮肤100mg，置于甲酰胺中（4ml/gww,20℃24小时），浸出的EB浓度在分光光度计上（OD620 nm)进行测定。（与由标准的已知浓度的EB测定所得的标准曲线进行比较而得）。结果以每mg皮肤干重所含EB的ng数表示。即ng/mg dw。
12．烫伤皮肤水肿程度的测定：准确称取烫伤皮肤100mg，置95℃烤箱24小时烤干，称量组织干重，以湿重／干重的比值表示组织水肿程度的轻重。
13．组织学检查：每只动物各取一小片切伤及烫伤皮肤，10％甲醛固定，酒精脱水，石蜡包埋，切成10μm薄片，行H－E染色，在光镜－观察组织病理学变化。
14．统计学处理：实验结果以均值±标准差（X±SD）表示，用ANOVA one way方法进行统计学处理。P＜0.05和0.01分别表示统计学上差异有显著意义和非常显著意义。
结果
创作3天时，肉眼可见切割伤皮肤表面有血凝块形成，局部红肿；镜下见表皮、真皮及皮下组织和筋膜连续性终断，伤口边缘有炎性白细胞浸润和成纤维细胞生成，并可见少许肉芽组织充填组织裂隙；烫伤皮肤表面苍白、肿胀；镜下见皮肤表层大片红染，有大量炎性细胞浸润。创伤6天时，切割伤皮肤表面块部分脱落，水肿减轻，镜下见肉芽组织增生活跃，表皮和真皮开始向切口靠拢，毛囊及汗腺结构存在。烫伤皮肤色泽变暗，水肿减轻，皮肤焦痂形成；镜下见皮肤表层大片红染，真皮及表皮结构消失和大量炎性细胞浸润，毛囊及汗腺结构消失。创伤9天时，切割伤表面血凝块脱落，伤口愈合，镜下见有瘢痕形成和少许炎性细胞浸润，表皮和真皮层连续性恢复；烫伤组织开始收缩；边缘焦痂开始脱落，镜下仍见有大量炎性细胞浸润。
1．体重改变
创伤后，大鼠体重均明显减轻，以术后3天时最为明显，术后6天和9天时逐渐恢复。术后3天时两创伤组大鼠体重减轻程度无明显差异（P＞0.05）；术后6天时，E组大鼠体重恢复显著超过C组，（P＜0.05）。如表1所示。
表1．创伤3、6、9天时大鼠体重改变（△g）
3天 6天 9天
C组 -8.63±2.0 -7.63±2.04 -3.5±1.93
E组 -8.88±2.30 -3.00±1.63** 2.19±1.69**
与C组比较＊P＜0.05 **P＜0.01
2.WBS改变
健康大鼠（S组）皮肤WBS均超过400g，而在切割后第3天时，C组WBS低于40g，而E组WBS则为C组1.5倍（P＜0.01）；术后6天和第9天时，E组WBS仍较C组显著增强，约为C组的1.5-1.6倍（P＜0.01），见表2。
表2．创伤3、6、9天时WBS改变（g）
3天 6天 9天
C组 31.75±8.64 141.26±23.14 207.75±38.10
E组 45.63±8.23** 221.13±50.21** 339.00±33.21**
S组 ＞400
与C组比较**P＜0.01 ７
3． 烫伤皮肤EB渗出改变
烫伤后皮肤EB渗出明显增加，术后3天时，两创伤组皮肤EB渗出约为S组的4－5倍，以后EB渗出随时间逐渐减轻。频谱治疗可明显减轻烫伤组织渗出（与C组相比，P＜0.01）；创伤后3天时，C组EB渗出量较E各治疗组高出约30％（P＜0.01），创伤6天时，E组EB渗出仅为C组的45％（P＜0.01）。创伤后9天时，E组EB渗出量进一步减低，仅为C组的50％（P＜0.01），见表3。
表3．创伤3、6、9天时EB渗出改变（ng/ma dw）
3天 6天 9天
C组 203.0±44.21 187.75±29.92 116.88±28.93
E组 141.25±31.24** 82.25±21.76** 61.13±17.60**
S组 41.88±8.61
与C组比较**P＜0.01
4.烫伤组织湿重／干重比值
健康大鼠（S组）皮肤湿重／干重比值为4.23±0.21，烫伤组织水肿，其比值增加。在C组，创伤后3天时，湿重／干重比值较S组增高30％（P＜0.01），6天时进一步增高，第9天时趋于下降，但仍高于S组。在创伤后3天时，频谱治疗组皮肤湿／干重比值增高程度与C组相近（P＞0.05），而在创伤后第6天时，在E组，其比值趋于下降，第9天下降更为明显（P＜0.01）。见表4。
表4．烫伤3'6'9组织湿／干重比值改变
3天 6天 9天
C组 5.32±0.29 5.54±0.34 4.91±0.35
E组 5.26±0.57 4.47±0.36** 4.26±0.39**
S组 4.22±0.21
与C组比较**P＜0.01
5.烫伤皮肤3H－TdR掺入的改变
创伤3天时，C组3H－TdR掺入与健康大鼠皮肤（S组）相比差异无显著性意义（P＞0.05）。而在E组3H－TdR掺入增加80％（P＜0.01），表明上述治疗可促进DNA合成；创伤6天时，C组3H－TdR掺入较S组增高了1倍（P＜0.01），而E组则增高至S组的3.5倍左右（P＜0.01）；创伤后9天时，两创伤组3H－TdR掺入均趋于下降，但E组仍高于C组（P＜0.01）。见表5。
表5．创伤3、6、9天时组织3H－TdR掺入改变(cpm/mg dw)
3天 6天 9天
C组 876.63±178.76 1827.63±337.15 1407.63±283.93
E组 1236.88±259.98* 3437.88±492.45** 2194.13±381.59**
S组 994.38±361.74
与C组比较＊P＜0.05 **P＜0.01
6.切割伤后皮肤羟脯氨酸含量的改变
健康大鼠（S组）皮肤羟脯氨酸含量约为2.5nmol/mg，创伤后3天时，C组和E组羟脯氨酸略有减低，但组间差异无统计学意义（P＞0.05），创伤后第6天时，C、较S组增高0.7倍，而E组羟脯氨酸含量则为S组的3倍，明显高于C组（P值均小于0.01）；创伤后9天时，两创伤组羟脯氨酸含量下降至相似水平（P＞0.05）。见表6。
表6．创伤3、6、9天时组织羟脯氨酸含量改变（nmol/mg ww）
3天 6天 9天
C组 2.05±0.61 4.19±1.28 2.74±0.41
E组 2.21±0.46 7.57±1.37** 2.80±0.54
S组 2.51±0.31
与C组比较**P＜0.01
7.切割伤和烫伤组织GFs活性的改变
创伤后GFs活性较健康大鼠（S组）皮肤明显增高，但切割伤后3天时，C组和E组间差别无显著性（P＞0.05）；创伤后6天时，E组GFs活性显著高于C组（P＞0.05）；第9天时，E组与C组GFs活性增高至相似水平（P＞0.05）。在烫伤后3天时，E组和C组间GFs活性的差异无显著性（P＞0.05）。烫伤后第6天时，E组GFs活性显著高于C组，（P＜0.05）；烫伤后9天时C组和E组GFs活性渐趋下降；但E组GFs活性仍高于C组（P＜0.05）。见表7和表8。
表7．创伤3、6、9天时切割伤组织GFs活性改变（％）
3天 6天 9天
C组 56.76±6.83 55.60±10.34 52.09±7.19
E组 62.88±8.31 69.21±7.72* 60.96±8.94
S组 40.66±6.15
与C组比较＊P＜0.05
表8．创伤3、6、9天时烫伤组织GFs活性改变（％）
3天 6天 9天
C组 46.39±6.58 63.91±8.27 55.61±10.81
E组 40.59±6.99 78.36±9.59** 68.39±7.34*
S组 38.65±6.47
与C组比较＊P＜0.05 **P＜0.01
8.烫伤组织MPO含量的变化
创伤后3天时，各烫伤组皮肤MPO增高至S组的5倍以上，且C组和E组间MPO含量差异无显著性（P＜0.05）；烫伤6天时，创伤组MPO含量进一步增加，E组MPO含量增高至S组的11倍，显著高于C组（P＜0.01）；烫伤后9天时，C组和E组MPO含量都渐趋下降。以E组减低最为明显，与C组比较有显著性差异（P＜0.05）。见表9。
表9．烫伤3、6、9天时组织MPO含量的变化(mU/mg dw)
3天 6天 9天
C组 209.88±40.86 298.63±41.69 157.0±31.01
E组 219.88±71.32 432.63±47.60** 107.38±33.94*
S组 40.56±5.63
与C组比较＊P＜0.05 **P＜0.01
9.烫伤组织脂质过氧化产生MDA含量的变化
烫伤后3天时，C组和E组MDA含量增高至S组的2-3倍（P＜0.01），且组间MDA含量无显著性差异（P＞0.05）；术后第6天，C组MDA含量进一步增高，而E组MDA含量则趋于下降，与C组比较差异有高度显著性（P＜0.01）；术后第9天，C组MDA含量趋于下降，而E组MDA含量下降更为明显，与C组比较，差异有高度显著性（P＜0.01）。见表10。
表10．创伤3、6、9天时烫伤组织MDA含量的改变(mU/mg dw)
3天 6天 9天
C组 4.53±0.64 5.35±0.92 4.08±0.81
E组 4.78±1.13 3.46±0.56** 2.49±0.55**
S组 1.59±0.31
与C组比较**P＜0.01
讨论
创伤不仅引起组织局部损伤，也引起全身反应，创伤在造成组织创伤和功能代谢障碍的同时又激发了机体的防御反应和组织修复过程。创伤治疗的宗旨在于减轻组织局部和全身损伤、增强机体的防御和代偿功能、促进创伤组织的修复和愈合。本实验在经病理组织学检查证实为全层皮肤切割伤和深Ⅱ度烫伤的大鼠模型上，观察到其创伤的主要病理生理表现为：
1． 创伤后大鼠体重减轻，以创伤后3天时最为明显，以后逐渐趋于恢复，但至第9天时仍未达到创伤前体重水平。
2． 烫伤皮肤的完整性遭到破坏，组织毛细血管通透性增加，正常时不易透过血管壁的大分子物质（如EB及血浆蛋白等）大量渗入组织间隙，使组织中EB含量倍增，组织水肿，湿重／干重比值增高；切割伤使皮肤连续性遭到破坏，组织WBS明显减低，上述改变以创伤后早期最为明显，以后随创伤的修复而逐渐恢复。
3． 创伤组织的炎性细胞浸润，可吞噬伤口处异物及坏死组织，增强局部的免疫功能，并释放生长因子，促进创伤的愈合。但白细胞浸润持续时间过长，则可使局部发生慢性炎症和使瘢痕形成过度。本实验通过检测白细胞特有的酶系MPO观察到健康组织MPO活性极低，表示组织间极少或无白细胞浸润，而创伤后局中组织MPO活性增高4－6倍，以创伤后6天时最为明显，9天时逐渐减低。
4． 创伤后局部组织氧自由基激活，脂质过氧化产物－MDA大量积聚，在本实验中6天时达峰值，9天时渐趋下降。
5． 创伤后组织修复，局部GFs活性增高，3H－TdR掺入增加，组织羟脯氨酸含量增高。GFs是一类促细胞增生的生物活性多肽是促进创伤愈合的最理要因素之一。在创伤愈合过程中，GFs表现出多功能性，包括促进细胞分裂增殖，调节细胞的趋化迁移及多种物质的合成与分泌等。胸腺嘧啶（TdR）为DNA合成过程中的必需底物，且在不同DNA分子中含量较为恒定，故3H－TdR掺入反映了创伤组织DNA的合成情况。羟脯氨酸为胶原蛋白的主要组成成分，且在胶原中含量较为恒定，极少存在于其它组织蛋白，故创伤组织羟脯氨酸含量的增加反映了组织胶原合成过程的增强。本实验观察到创伤后3天时组织GFs活性明显增强、羟脯氨酸含量增加，在6天时达高峰，9天时趋于下降，组织DNA合成也是在创伤后第6天时达高峰，第9天时开始下降，但仍明显高于正常组织。
频谱是一种波谱范围较宽广的电磁波，大量临床和实验研究都发现频谱仪对改善局部循环，改善局部损伤组织的功能和代谢紊乱有相当好的疗效。本实验在复合创伤的大鼠模型上观察到频谱仪治疗具有减轻组织损伤，促进创伤愈合修复的疗效，主要表现为：
1．频谱仪治疗可促进创伤大鼠体重的恢复，与未治疗组动物比较，在治疗的第6天体重恢复即呈现出显著差异，第9天时体重恢复更为明显。
2． 频谱仪治疗可组织的损伤，在治疗早期即可明显抑制血管通透性的增加，缓解组织的水肿程度，减轻创伤组织的脂质过氧化反应。
3． 频谱仪治疗促进创伤组织的修复，与未治疗组相比较，早期便可促进局部组织GFs活性增高，在创伤第6天时即表现出促进细胞增生（DNA合成增加）和胶原合成增加。另外，频谱仪尚可促进局部组织白细胞浸润，并使其峰值前移，同时又可促进白细胞浸润的及早消退，避免了局部形成慢性炎症。修复最终表现为组织完整性的恢复，即WBS的增强。
据研究[9]，周林频谱仪具有极宽的电磁能量辐射频谱，约从2μm直到微波高端都可测到该仪器不同强度的电磁能量辐射，其范围覆盖了中、远红外，亚毫米波、毫米波宽广的谱域。并认为生命物质中存在有5×103至3×1012HZ的相干电磁振荡，其波长为100μm－6mm，这种相干振荡不仅存在于单纯细胞系统，而且存在于更高级的系统中，尤其是生物细胞组织中。在控制生物组织生长中发挥着重要作用。频谱仪除可通过生物大分子的相干膜振荡产生红外线的热效应外，另外还认为微波电磁能可以激发非热电生物效应，产生治疗作用，后者为生物的一种非线性响应过程，所需的激励能量是在外界微波触发下由生物系统本身供应的。因此，在一定条件下，外界仅需供应很少能量的微波电磁能进行激发，生物组织即可产生通常意义下需要很高能量才能产生的非热电生物效应。周林频谱仪正是模拟生物体频谱的方法首创性地将生物热效应和非热电生物效应相结合，研制出的一种新型的生物理疗仪。由频谱仪产生的辐射频谱与生物大分子相干膜振荡频率相一致，能以远低于电磁辐射安全标准的弱电磁能激发生物体产生较强的受激相士共振吸收效应。使电磁能易于被皮肤和皮下组织吸收，并通过所产生的生物热及非生物热效应作用于皮肤神经末梢、毛细血管及免疫细胞起局部治疗作用。本研究也发现：频谱仪治疗对于减轻组织创伤和促进创伤组织的修复具有确切疗效，其作用机理可能通过以上生物热效应和非生物热效应，促进和诱导机体内源性抗损伤能力的产生，其作用机理仍需进一步探讨。
