生物频谱对神经膜钠通道内流电流调制作用初探

南开大学 生物系细胞研究室 刘安西、赵勇、杜志琴

云南省生物医学工程研究所 周 林

WS－生物频谱仪是治疗某些疾病的有效手段，受到广大患者欢迎。目前，善于治疗仪在临床上的应用研究日趋增多，作用机理的研究也日见重视。生物体一切生命活动是通过神经细胞对外界刺激（包括生物频谱）产生电信号－神经脉冲来完成的。一切生物电包括神经电活动在内都是通过细胞膜的大分子蛋白即离子通道的构象变化，Na+内流造成的。因此离子通道特别是Na+通道是生物电的分子基础；是许多药物的作用靶，当然也是"生物频谱"的作用靶。从细胞分子水平研究"生物频谱"与生物电的关系，对生物效应的作用机理，在理论上和实践中都将具有很大意义。为此，本文用近代电生理电压钳位法（Voltage clamp method）研究了WS－生物频谱治疗仪对神经膜Na,K通道离子电流的调节作用，探讨WS－生物频谱对生物体神经脉冲的产生，传导的影响和调节机制，为生物频谱作用机理提供理论线索。

实验材料和方法

一、 实验材料

１． 神经－肌肉突触电位材料： 实验用成年健康S．D.大鼠，体重150－200g（天津医学实验动物中心）。将大鼠断头，取其左侧隔肌和隔神经，置于灌流槽中，以不锈钢针固定。灌流槽恒温37±1℃，生理液中加有95％O2＋5％CO2饱和溶液。实验时在高倍镜下找到神经－肌肉接头终板区，半玻璃微电极插入终板区，记录肌细胞膜静息电位和自发释放的小终板电位（mEPP)

2. 神经膜电流材料：将大白鼠麻醉后，剪开腹部剥离出膈神经，离体置于玻片上，滴加生理盐水溶液，于高倍双目镜下，用玻璃针小心剥离出单根大轴突（神经细胞），直径约40μm，然后剪断其它所有轴突。此轴突用于电压钳位和膜电流试验。

二、 实验方法――油间隙、单纤维、电压钳位法

１． 油间隙、电压钳位神经小室的制作： 神经小室由8×4×3㎝的有机玻璃粘合而成。小室底部中央有一直径2mm的小管，一端注入生理溶液，另端流出。管道中央开有微孔，直径100μm，其两侧各有一根AgCl丝，分别为I电极和V电极。将离体轴突放于微扎处并于I．V电极相连。然后滴加液体石蜡，复盖全部神经和电极。这样便可以进行电压钳位实验了。全部信号通过电压钳位放大器放大后于记忆示波器上显示并记录。数据送入微型计算机处理并打印出曲线图，以保证实验精度。

２． WS－生物频谱仪照射程序： 照射源距神经轴突25－30㎝。为了使照射源稳定工作，照射前，频谱仪预热10－15分钟；实验时照射10分钟。对照组用相同功率的红外线灯照射，为了防止照射源过近损伤轴突，除适当延长距离外，其它参数与实验组相同。神经－肌肉突触实验照射程序为：照射前频谱仪开机稳定15min，然后以弱档照射10 min，距离30㎝。红外灯（PHILP3，HP3690）照射10 min，距离50㎝，其结果做为对照射。

三、 试剂：

１． 四氨基吡啶溶液（4－aminopyridine,4-AP）：配制成4×10－6mMol/L溶液。钾通道阻断剂。

２． 河豚毒素溶液（tetrodotoxin,TTX）：配制成2×10－6mMol/L溶液。钠通道阻断剂。

３． 大白鼠生理溶液：NaCl 147 mMol/L；KCl：154 mMol/L；CaCl2 1.8 mMol/L；葡萄糖5.5 mMol/L；NaH2PO4 1.2 mMol/L；Na2HPO4 4.8 mMol/L；HEPE 2.6 mMol/L。PH 7.2。

实验结果

一、 WS－生物频谱对神经－肌肉突触mEPP的兴奋作用。

正常条件下，大鼠隔肌的静息电位为－60～－70mV。自发释放的小终板电位mEPP幅值为0.2～0.8 mV,发放频率为0.2～0.4个／sec，不同材料个体之间有一定差异，但是对于一个个体来说，其mEPP的频率，幅值是相对稳定的。然后用WS－生物频谱仪（WS－111A）照射10min，其mEPP的发放频率达0.4～0.8个／sec，幅值为1.0～4.0 mV分别是正常值的2倍和5倍。

红外线灯照射10min，mEPP的发放频率为0.27-0.48个／秒，幅值为0.5～0.70 mV，分别增加约1.2倍和2.3倍。因此，WS－生物频谱仪对自发释放的小终板电位mEPP的发放频率比正常值可增加0.8倍，幅值约2.7倍，对神经－肌肉突触传递有兴奋作用。（图－．B）效果优于红外灯。

二、 WS－生物频谱对神经膜钠通道电流INa的调制作用。

1．在电压钳位条件下，保持电位（holding potential.H.P）H.P=-15mV，膜电位Vm=-10mV,可记录到一个先向下弯曲的内流钠电流[图二.A.(1)](inward sodium current) INa和一个向上弯曲的钾电流[图二.A.(1)](steady-state outward potassium current) Ik，Vm=-20 mV时，INa达到最大值，为-0.42μA.cm2。其峰值随膜电位的增加而减少。INa出现快但持续去极化会衰减直到最后消失（失活）。因此钠通道的激活曲线为"S"形；失活曲线为抛物线形。INa为内流电流，是负值，在电流－电压关系曲线（I－V）中位于横座标的下方（图二．B）。IK是正值，位于横座标上方。IK随膜电位增加而增加，最大值为0.27μA.cm2，以上生理特征很重要，直接与频谱的生物效应有关。

2．为了观察生物频谱对INa的作用，在生理溶液中加入了4×10－4mMol/L4-AP溶液，以阻断钾通道电流IK。在相同的电压钳位条件下，保持电位H．P＝－15 mV，Vm=-20mV，频谱仪照射6分钟，INa峰值增加，10分钟时，达到最大值INa＝－0.57μA.cm2，比正常值－0.42μA.cm2增加约15.5％；停止照射5分钟后，INa逐渐恢复正常[图二.A.(3)．（4）]。对照组用相同功率的红外线灯照射10分钟，距离40－50cm，INa＝－0.45μA.cm2，约增加3.4％；比正常值略有增加[图二.A.(2)]。

因此频谱仪照射后，INa峰值增加约12.1％。详见表一。

表一 WS－生物频谱治疗仪对大白鼠神经膜INa的影响

注：H．P＝－15 mV，Vm=-20mV

二、WS－生物频谱对神经膜钾通道电流IK的作用。

在生理溶液中加入2.0×10－6mMol/L TTX，阻断钠通道电流INa，观察频谱对IK的影响。保持电值H．P＝10mV，Vm=20mV，IK峰值为0.30μA.cm2。此时生物频谱照射3－4分钟，IK增加；照射10分钟后，IK达到最大值，IK＝0.52μA.cm2，比正常值增加约26.8％。[图三．K－WS]。 同样条件，用红外线灯照射10分钟，IK＝0.37μA.cm2，比正常值增加约10.4％，因此生物频谱可以使IK增加约16.4％。[图三．K－R]。

表二 WS－生物频谱治疗仪对大白鼠神经膜IK的作用

注：H．P＝10mV，Vm=20mV
钾通道离子电流IK是膜兴奋性的分子基础，对降低神经膜阈电位有关，它可以直接影响神经膜的静息电位。

讨论

实验结果表明WS－生物频谱治疗仪可以直接影响神经膜钠离子通道电流INa，使其峰值增加，神经处于兴奋状态。宏观表现为神经电信号如：自发释放的微终板电位mEPP的发放频率，幅值均有增加。

在轴突膜上（神经细胞）有许多钠离子通道和钾离子通道，以上记录的是许多通道的总电流，根据经验，电流峰值增加，通道开放时间必然延长，这就需要对钠单通道开关动力学过程即通道开放时间，关闭时间、电导变化、门控机理等进一步实验研究，才能对生物频谱方法作用机理作出更有价值的解释。

图目：

图一 WS－生物频谱治疗仪对大鼠膈神经－膈肌神经－肌肉突触小终板电位mEPP的兴奋作用。

A． 照射前mEPP正常发放。

B． 照射10分钟后，mEPP发放频率、幅值均明显增加。

图二 WS－生物频谱治疗仪对神经膜Na通道内流电流INa、外流K电流IK的调节作用。

A．（1）正常INa，INa＝－0.42μA.cm2， （2）红外线灯照射10分钟INa＝－0.45μA.cm2 （3）生物频谱照射INa＝0.51μA.cm2，6分钟； （4）生物频谱照射INa＝0.57μA.cm2，10分钟；

B．I－V关系曲线图 Na+曲线：正常值 Na－WS：生物频谱曲线，照射10分钟 Na－R：红外线灯照射10分钟曲线 H．P＝－15 mV，Vm=-20mV

图三 WS－生物频谱治疗仪对神经膜K通道外流电流IK的调节作用。

K+：正常外流K电流IK最大值为0.30μA.cm2 K－R：红外线灯照射10分钟曲线 IK最大值为0.37μA.cm2 K－WS：生物频谱照射10分钟曲线 IK最大值为0.52μA.cm2 H．P＝10mV，Vm=20mV （此处有图一，A和B，P11；图二，P12；图三，P13。）