ＷＳ频谱仪对应激大鼠血小板聚集的影响

北京医科大学 生物物理系 侯 琳 岳新萍 凌世长 程 时

许多慢性病都由微循环不畅引起的。为了观察周林频谱仪对血液流变学及血小板聚集是否有影响，我们利用冰水应激模型，诱发动物血小板聚集，用电镜观察聚集型的血小板及心肌小血管的血小板，从而检测周林频谱仪对血小板活性的影响。

材料与方法

一、 仪器

周林生物频谱仪１０１Ｄ型（周林公司提供） 透射电子显微镜Ｈ－５００（日立），ＪＥＭ－１００ＣＸⅡ（电子）

二、动物与动物处理：

wistar大鼠，雌雄各半，３００g左右。分为四组，Ａ组、Ｂ组、Ｃ组、Ｄ组，每组７只以上。Ａ组和Ｂ组接受８－１０天周林频谱仪的照射，每天两次，每次４０分钟，照射距离为２５厘米左右。Ｃ组和Ｄ组不照射。

三、实验方法：

１．取材及标本制作超薄切片：照射８－１０天以后，Ａ组和Ｃ组的动物做冰水应激试验，水温６０℃，水深约１５厘米，过程大致同Haft法，此处不赘述。待动物在冰水中精疲力竭，濒于溺水时，将其迅速由冰水中取出，猛击头部，砸昏，心脏取血。取血时用２％肝素抗凝，按１：９体积比例，做血小板聚集型观察的电子显微镜标本，取血后，开胸，迅速剪取跳动着的左心室近心尖部的心肌，做透射电子显微镜标本，按常规方法，戊二醛，饿酸双重固定，丙酮系列脱水，８１２包埋，６０℃聚合，ＬＫＢＶ型机切片、染色。Ｂ组和Ｄ组做为对照组，直接猛击头部后取材。

２．血小板聚集型电镜标本制作：在约１／２大小的显微镜载玻片上，铺一层0.5％formvar膜，置于有机玻璃盒中，然后将已抗凝的静脉血约2ml倾注于有机玻璃盒中的玻片上，３７℃温育８分钟，取出后用３７℃生理盐水冲洗至无色，自然干燥，然后用１％的Ｏ３Ｏ４染色１５分钟，再用清水冲洗，待自然干燥后将玻片置于显微镜下，挑选血小板较密的区域放上铜网，用透明胶纸将铜网固定后，将玻片放在清水盒中漂取铜网，即成电镜标本。

3． 电镜观察：①电镜下，血小板分单个包括圆型、树突型、扩展型和聚集型的，聚集型是由2个以上血小板聚集而成，计数时，聚集型作为１个血小板计数，将镜下见到的血小板连续计数２００个以上，然后计算血小板聚集型的百分比（附录图Ｃ１－４）。

②心肌细胞电镜观察，主要是记录心肌内血管数及含有血小板及其聚集物的血管数（附录图Ｃ５－６），每组数４００个以上的血管，计算堵塞的百分数。另外，还观察心肌亚微结构的变化（附录图Ｃ７－８）。

实验结果

1． 大鼠在冰水中应激时间为9.5-17分。７只照射后的大鼠应激时间平均为9.9分，９只没照射大鼠的应激时间平均为10.1分，在冰水中坚持时间长短与是否照射无关。

2． 用电镜观察血小板聚集型的比例，结果如表1:C组聚集型百分比为9.8％，而Ａ、Ｂ、Ｄ组分别是4.5％，2.9％，3.7％，从此表中可看出Ｂ组、Ｄ组与Ｃ组聚集型比例有显著差异（t检验Ｐ＜0.001），而Ａ组与Ｃ组也有明显的差异(t检验0.01＞Ｐ＞0.001)。

表１：聚集型血小板百分比

  照射＋应激（Ａ） 照射（Ｂ） 应激（Ｃ） 对照（Ｄ）
动物只数
１
２
３
４
５
６
７
８
９		 ７
6.5％
4.8％
4％
5％
5.8％
3.7％
1.5％		 ７
3.7％
4.3％
3％
3.2％
1.2％
3.5％
1.1％		 ７
9.9％
14.2％
12％
7％
12.3％
7.5％
3.9％
15.6％
6.2％		 ７
1.4％
4.0％
3.0％
5.0％
7.7％
2.6％
2.6％
4.7％
2.3％
均数
ＳＤ
ＳＥ		 4.5％
1.6
0.6		 2.9％
1.2
0.5		 9.8％
4.0
1.3		 3.7％
1.9
0.6

３．对每只动物心肌超薄切片平均观察60-70个血管（主要系毛细血管）。每组均为７只动物。单纯应激组即Ｃ组共观察５５２个血管，含有血小板及聚集物的血管数为１６个，占2.9％，７只动物中每只心肌血管中都出现血小板聚集物；而周林频谱仪照射后再应激组即Ａ组，共观察血管５１８个，仅２只动物血管中出现聚集物，含有聚集物的血管数有３个，占0.58％；单纯照射组即Ｂ组，观察血管４６３个，２只动物中出现聚集物，含聚集物血管数２个，占0.43％；正常对照组即Ｄ组，观察血管４４３个，含聚集物血管数０个，为０％。从表２及经过离散型资料的分析（假设检验）得出，Ａ组、Ｂ组、Ｄ组与Ｃ组含有血小板聚集物的血管比例数均有差异，Ａ组和Ｂ组与Ｃ组比均是Ｐ＜0.01，Ｄ组与Ｃ组比P＜0.001。

表２：心肌血管内血小板及聚集物的百分比

  Ａ Ｂ Ｃ Ｄ
动物只数
心肌血管数
含血小板及聚集血管数
血小板及聚集物的血管百分比		 ７
518
3
0.58％		 ７
463
2
0.43％		 ７
552
1
62.90％		 ７
443
0
0％

 

讨论

１． 冰水应激引起血小板聚集性增高，从而引起心肌损伤是个成熟的实验模型。周林频谱仪照射后可减少冰水应激诱发的心肌血管中血小板聚集，此与同组动物血小板聚集型观察的结果即减少血小板聚集型比例相一致。血小板是血栓形成的起动者，也是血栓形成的核心，血小板聚集是血栓形成的第一步。微循环内的血小板聚集可引起循环不畅，血流瘀滞，这与许多慢性疾病（如缺血性的心脑血管病）有关，心肌内小血管中有较多的血小板聚集物可造成心肌损伤。周林频谱仪照射可减轻由于心肌血管中血小板聚集物的形成而加重的冰水应激对大鼠心肌的损伤。

２． 线粒体的破坏无疑是由缺氧造成，这种损伤单纯应激组更为明显。动物在冰水中惊恐惧怕，激烈挣扎，用尽最大力气要摆脱险境求得生存。在这种情况下，心肌氧的供求之间容易发生不平衡，而此时血管中血小板聚集物的阻塞使得微循环不通畅，便加重了组织的缺氧。经周林频谱仪照射后，在同样情况下，由于血管中聚集物较少，组织病变较轻。

３． 动物照射处距频谱仪25cm，测得温度为31.5℃。因此，我们认为该仪器对动物冰水应激血小板聚集及心脏损伤可明显减轻非热效应。